USP34 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409215-ACT

USP34 codifica una proteasi specifica per l’ubiquitina che inverte l’ubiquitinazione delle proteine per regolare la stabilità proteica e l’output dei segnali. È stata collegata al controllo dell’attività della via WNT/β-catenina attraverso la stabilizzazione, dipendente dalla deubiquitinazione, di componenti chiave della via, influenzando programmi trascrizionali che governano la proliferazione e le decisioni di destino cellulare. L’attività di USP34 interseca inoltre processi legati alla proteostasi e al danno al DNA mediante la modulazione del turnover dipendente dall’ubiquitina e della segnalazione dei checkpoint. Una segnalazione dell’ubiquitina deregolata che coinvolge USP34 è stata associata ad alterazioni del controllo della crescita e del mantenimento del genoma in contesti di biologia tumorale, rendendola rilevante per studi meccanicistici delle vie oncogeniche.

USP34 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di USP34 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

USP34 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus USP34 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione USP34, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di USP34. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus USP34 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da USP34 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via USP34 nelle cellule tumorali con espressione di USP34 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.