USP14 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403167-ACT

USP14 codifica un enzima deubiquitinante associato alla particella regolatoria 19S del proteasoma 26S, dove accorcia le catene di ubiquitina e modula la processazione dei substrati prima della degradazione. Controllando il riciclo dell’ubiquitina e la capacità di processamento del proteasoma, USP14 influenza la proteostasi cellulare, le risposte allo stress e l’equilibrio tra controllo qualità delle proteine e turnover. Questa attività si intreccia con vie che regolano la progressione del ciclo cellulare, le risposte al danno al DNA e reti di segnalazione sensibili alla regolazione ubiquitina-dipendente. Alterazioni della funzione di USP14 sono state studiate in contesti di squilibrio della proteostasi e di deregolazione della segnalazione ubiquitina–proteasoma, rilevanti per la neurobiologia e per fenotipi associati al cancro.

USP14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di USP14 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

USP14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus USP14 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione USP14, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di USP14. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus USP14 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da USP14 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via USP14 nelle cellule tumorali con espressione di USP14 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.