USP14 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403167-ACT

USP14 kodiert ein deubiquitinierendes Enzym, das mit dem 19S-Regulatorpartikel des 26S-Proteasoms assoziiert ist. Dort kürzt es Ubiquitin-Ketten und moduliert die Verarbeitung von Substraten vor deren Abbau. Durch die Kontrolle des Ubiquitin-Recyclings und des Proteasom-Durchsatzes beeinflusst USP14 die zelluläre Proteostase, Stressantworten sowie das Gleichgewicht zwischen Proteinqualitätskontrolle und Proteinumsatz. Diese Aktivität überschneidet sich mit Signalwegen, die den Zellzyklus, DNA-Schadensantworten und Signalnetzwerke steuern, die empfindlich auf eine Ubiquitin-abhängige Regulation reagieren. Eine veränderte USP14-Funktion wurde im Kontext von Proteostase-Ungleichgewichten und fehlregulierter Ubiquitin–Proteasom-Signalgebung untersucht, die für neurobiologische Prozesse und krebsassoziierte Phänotypen relevant ist.

USP14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen USP14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

USP14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des USP14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der USP14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen USP14-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native USP14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von USP14-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des USP14-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem USP14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.