Unc18-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403691-ACT

STXBP2 codifica la proteina legante la sintassina 2 (Unc18-2), un regolatore della famiglia Sec1/Munc18 dell’assemblaggio del complesso SNARE, necessario per l’ancoraggio delle vescicole e la fusione di membrana. Nelle cellule immunitarie, Unc18-2 sostiene l’esocitosi dei granuli citotossici e la secrezione regolata, integrandosi con le vie che controllano la degranulazione, il traffico endolisosomiale e il rimodellamento della membrana. Alterazioni della funzione di STXBP2 sono state collegate a fenotipi di disregolazione immunitaria, rendendolo rilevante per lo studio dei difetti di secrezione mediata da vescicole e dei programmi di segnalazione infiammatoria a valle. La sua attività è inoltre informativa in contesti più ampi di controllo della via secretoria, inclusi il riciclo dei recettori e la comunicazione cellula-cellula.

Unc18-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di STXBP2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Unc18-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus STXBP2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione STXBP2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Unc18-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus STXBP2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Unc18-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Unc18-2 nelle cellule tumorali con espressione di STXBP2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.