UBC2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404360-ACT

UBE2A umano codifica l’enzima E2 coniugante l’ubiquitina UBC2, un componente centrale del sistema ubiquitina–proteasoma che trasferisce l’ubiquitina attivata dagli enzimi E1 alle ligasi E3 per sostenere l’ubiquitinazione dei substrati. Attraverso questa attività, UBC2 contribuisce a regolare il controllo di qualità delle proteine, la progressione del ciclo cellulare e le risposte al danno al DNA, modulando le reti di segnalazione dell’ubiquitina e della proteostasi. La funzione di UBE2A/UBC2 è collegata a vie che governano il turnover delle proteine regolatorie e l’adattamento allo stress, rendendolo rilevante per studi sullo sviluppo neuronale, il mantenimento del genoma e l’omeostasi cellulare. Alterazioni delle dinamiche di ubiquitinazione che coinvolgono UBE2A sono state associate a fenotipi di neuro-sviluppo e a una proteostasi deregolata in contesti rilevanti per la malattia.

UBC2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UBE2A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UBC2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UBE2A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UBE2A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UBC2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UBE2A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UBC2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UBC2 nelle cellule tumorali con espressione di UBE2A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.