U2AF35 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404986-ACT

U2AF1 umano codifica U2AF35, un componente centrale del fattore ausiliario di splicing U2 che riconosce il sito di splicing 3′ e contribuisce al reclutamento dello snRNP U2 durante l’assemblaggio dello spliceosoma. In associazione con U2AF2 (U2AF65) e tramite l’interazione con i tratti polipirimidinici e con caratteristiche delle giunzioni di splicing, U2AF35 contribuisce alle decisioni di splicing alternativo che determinano la produzione di isoforme di mRNA, la stabilità dei trascritti e la diversità proteica. I programmi di splicing dipendenti da U2AF1 si intersecano con l’elaborazione dell’RNA, l’accoppiamento con la trascrizione e il controllo del ciclo cellulare, rendendolo un nodo chiave della regolazione genica post-trascrizionale. Alterazioni ricorrenti di U2AF1 e firme di splicing deregolate sono associate alla biologia delle neoplasie ematologiche e a perturbazioni più ampie delle vie dello splicing dell’RNA, supportandone l’impiego in studi meccanicistici sulla funzione dello spliceosoma e su cambiamenti di splicing rilevanti per la malattia.

U2AF35 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di U2AF1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

U2AF35 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus U2AF1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione U2AF1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di U2AF35. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus U2AF1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da U2AF35 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via U2AF35 nelle cellule tumorali con espressione di U2AF1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.