tsg 101 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-423524-LAC

Il gene murino Tsg101 codifica il gene di suscettibilità tumorale 101 (tsg101), un componente fondamentale del complesso ESCRT-I che coordina lo smistamento endosomiale, la biogenesi dei corpi multivescicolari e la degradazione lisosomiale delle proteine di membrana ubiquitinate. Attraverso il rimodellamento di membrana dipendente da ESCRT, TSG101 contribuisce anche all’abscissione durante la citochinesi e supporta la biogenesi delle vescicole extracellulari, collegandolo alla proteostasi e alla comunicazione intercellulare. L’alterazione o la disregolazione dei componenti della via ESCRT, incluso TSG101, è stata associata a un traffico recettoriale modificato, a risposte allo stress e alla stabilità genomica, rendendo Tsg101 un nodo utile per studiare la dinamica della segnalazione oncogenica e la proteotossicità rilevante per la neurodegenerazione. Nei modelli murini, perturbare Tsg101 aiuta a indagare come il flusso endolisosomiale influenzi il turnover dei recettori dei fattori di crescita e le vie a valle, come la segnalazione MAPK e PI3K associate a EGFR.

Le particelle di attivazione lentivirale tsg 101 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Tsg101 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale tsg 101 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Tsg101, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di tsg 101. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Tsg101 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.