Trypsin-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401128-ACT

PRSS1 codifica la tripsina-1, una proteasi serinica secreta prodotta principalmente dalle cellule acinose pancreatiche e sintetizzata come zimogeno inattivo, che viene attivato nel lume intestinale. La tripsina-1 attiva avvia cascate proteolitiche processando le proteine alimentari e attivando altri enzimi digestivi, e può anche attivare reti di segnalazione dipendenti da proteasi quando è localizzata in modo anomalo. Una regolazione rigorosa tramite processamento dello zimogeno, inibitori endogeni e compartimentalizzazione è essenziale per prevenire proteolisi inappropriata e danno cellulare. Un’espressione o un’attivazione deregolata di PRSS1 è implicata in patologie infiammatorie pancreatiche ed è stata studiata nel contesto della disfunzione del pancreas esocrino e dell’attività proteasica associata ai tumori.

Trypsin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRSS1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Trypsin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRSS1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRSS1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Trypsin-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRSS1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Trypsin-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Trypsin-1 nelle cellule tumorali con espressione di PRSS1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.