TRPC5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403745-ACT

TRPC5 codifica un canale cationico non selettivo permeabile al Ca2+ della famiglia dei canali TRPC (transient receptor potential canonici), che contribuisce all’ingresso di calcio mediato dai recettori a livello della membrana plasmatica. TRPC5 integra segnali a valle dei recettori accoppiati a proteine G e delle tirosin-chinasi recettoriali attraverso vie dipendenti dalla fosfolipasi C, modulando la dinamica intracellulare del Ca2+ che regola l’eccitabilità di membrana, il rimodellamento del citoscheletro e le risposte trascrizionali. L’attività del canale è stata collegata alla segnalazione neuronale e sensoriale, alla fisiologia vascolare e renale e alla modulazione della migrazione cellulare. La deregolazione della segnalazione di TRPC5 è spesso studiata nel contesto del dolore e di comportamenti legati all’ansia, del danno ai podociti e dei meccanismi delle nefropatie proteinuriche, nonché della motilità delle cellule tumorali e dei fenotipi di risposta ai farmaci.

TRPC5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRPC5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRPC5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRPC5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRPC5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRPC5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRPC5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRPC5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRPC5 nelle cellule tumorali con espressione di TRPC5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.