TMEM167B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410050-ACT

TMEM167B codifica una proteina transmembrana multipasso implicata nel traffico di membrana e nell’organizzazione del sistema endomembranoso, con un arricchimento riportato in compartimenti secretori e vescicolari. Studi emergenti collegano TMEM167B alla regolazione di processi di omeostasi cellulare come lo smistamento delle proteine e la segnalazione associata agli organelli, che possono influenzare la disponibilità dei recettori e la reattività delle vie di segnalazione a valle. Pattern di espressione alterati sono stati osservati in molteplici dataset omici, a supporto di ulteriori indagini su TMEM167B in contesti che includono l’adattamento allo stress cellulare e programmi di crescita deregolati. Essendo una proteina di membrana relativamente poco studiata, TMEM167B si presta bene a ricerche meccanicistiche volte a mappare fenotipi dipendenti dal traffico e a identificare interazioni genetiche.

TMEM167B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TMEM167B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TMEM167B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TMEM167B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TMEM167B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TMEM167B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TMEM167B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TMEM167B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TMEM167B nelle cellule tumorali con espressione di TMEM167B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.