TIMP-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400408-ACT

TIMP1 codifica l’inibitore tissutale delle metalloproteinasi-1 (TIMP-1), una glicoproteina secreta che si lega a diverse metalloproteinasi della matrice (MMP) e ne inibisce l’attività, regolando il turnover della matrice extracellulare e la proteolisi pericellulare. Limitando l’attività delle MMP, TIMP-1 influenza la migrazione e l’adesione cellulare, nonché il rimodellamento tissutale, e si integra con reti di segnalazione che collegano la dinamica della matrice alle risposte cellulari, inclusi processi infiammatori e fibrotici. La deregolazione dell’espressione di TIMP1 è spesso studiata in contesti di rimodellamento anomalo della matrice, come fibrosi, infiammazione cronica e biologia del microambiente tumorale, in cui un’alterata omeostasi della ECM può influenzare fenotipi associati a invasione e metastasi. Essendo un gene legato al cromosoma X e ampiamente espresso, TIMP1 è anche un utile marcatore per indagare l’equilibrio tra proteasi e antiproteasi in diversi tipi cellulari umani.

TIMP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TIMP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TIMP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TIMP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TIMP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TIMP-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TIMP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TIMP-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TIMP-1 nelle cellule tumorali con espressione di TIMP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.