Plasmide CRISPR d'Activation (h) Thymidine Kinase: sc-402954-ACT

Le gène humain TK1 code la thymidine kinase 1, une enzyme cytosolique qui phosphoryle la thymidine en monophosphate de thymidine dans la voie de sauvetage des pyrimidines, contribuant au maintien de pools équilibrés de dTTP nécessaires à la réplication et à la réparation de l’ADN. L’expression de TK1 est étroitement liée à la phase S et à l’état prolifératif, en s’intégrant aux programmes de régulation du cycle cellulaire et du métabolisme des nucléotides qui influencent la stabilité du génome. Des altérations de l’activité et de l’expression de TK1 ont été associées à une prolifération dérégulée et à des réponses aux dommages de l’ADN perturbées dans la biologie des cancers et dans d’autres contextes où le stress réplicatif est marqué. En tant que marqueur et acteur de l’homéostasie des nucléotides, TK1 est fréquemment utilisé pour étudier la dynamique de réplication, le flux de la voie de sauvetage et le contrôle métabolique dépendant du cycle cellulaire.

Thymidine Kinase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TK1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Thymidine Kinase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TK1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TK1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Thymidine Kinase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TK1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Thymidine Kinase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Thymidine Kinase dans les cellules tumorales présentant une expression de TK1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.