Thymidine Kinase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402954-ACT

Il gene umano **TK1** codifica la timidina chinasi 1, un enzima citosolico che fosforila la timidina a timidina monofosfato nella via di recupero (salvage) delle pirimidine, contribuendo a mantenere pool bilanciati di dTTP necessari per la replicazione e la riparazione del DNA. L’espressione di **TK1** è strettamente legata alla fase S e allo stato proliferativo, integrandosi con la regolazione del ciclo cellulare e con i programmi del metabolismo dei nucleotidi che influenzano la stabilità del genoma. Alterazioni dell’attività e dell’espressione di **TK1** sono state associate a proliferazione deregolata e a risposte al danno al DNA alterate nella biologia del cancro e in altri contesti in cui lo stress replicativo è marcato. In quanto indicatore e al tempo stesso determinante dell’omeostasi dei nucleotidi, **TK1** è spesso utilizzata per studiare la dinamica della replicazione, il flusso della via di recupero e il controllo metabolico dipendente dal ciclo cellulare.

Thymidine Kinase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Thymidine Kinase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Thymidine Kinase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Thymidine Kinase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Thymidine Kinase nelle cellule tumorali con espressione di TK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.