SR-1D Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404213-ACT

HTR1D codifica il recettore umano della 5-idrossitriptamina 1D (SR-1D), un GPCR accoppiato a Gi/o che lega la serotonina per inibire l’adenilato ciclasi, ridurre la segnalazione mediata da cAMP e modulare l’eccitabilità neuronale e il rilascio di neurotrasmettitori. SR-1D partecipa alla trasmissione sinaptica serotoninergica e a vie a valle che includono cAMP/PKA, MAPK/ERK e la regolazione dei canali ionici, con effetti funzionali influenzati dal traffico recettoriale e dalla desensibilizzazione. Le variazioni di espressione e di segnalazione di HTR1D sono state investigate nella biologia neurovascolare e neuropsichiatrica, inclusi meccanismi rilevanti per la fisiopatologia della cefalea e per l’elaborazione del dolore. Come modulatore presinaptico, SR-1D rappresenta un nodo sperimentalmente accessibile per analizzare il bias di segnalazione dei GPCR, la neurotrasmissione a livello di circuito e la dinamica recettoriale dipendente dal ligando in modelli cellulari umani.

SR-1D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HTR1D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SR-1D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HTR1D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HTR1D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SR-1D. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HTR1D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SR-1D nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SR-1D nelle cellule tumorali con espressione di HTR1D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.