Plasmide CRISPR d'Activation (h) Spastin: sc-402225-ACT

Le gène humain **SPAST** code la spastine, une enzyme AAA ATPase de sectionnement des microtubules qui remodèle le cytosquelette de microtubules en extrayant des sous-unités de tubuline de la matrice. La spastine contribue au maintien des axones, au trafic endosomal et du réticulum endoplasmique (RE), ainsi qu’aux événements de scission membranaire, en s’intégrant aux dynamiques du cytosquelette qui façonnent la croissance des neurites et le transport intracellulaire. Par ces fonctions, **SPAST** influence des voies qui régissent la distribution des organites et la connectivité neuronale dans les neurones à longues projections. Une dérégulation ou une perte d’activité de la spastine est fortement associée à la paraplégie spastique héréditaire et est fréquemment étudiée dans des modèles d’axonopathie et de défauts de trafic liés à la neurodégénérescence.

Spastin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SPAST sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Spastin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SPAST dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SPAST, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Spastin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SPAST natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Spastin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Spastin dans les cellules tumorales présentant une expression de SPAST silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.