Spastin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402225-ACT

Il gene umano **SPAST** codifica per **spastina**, un’ATPasi AAA con attività di taglio dei microtubuli che rimodella il citoscheletro dei microtubuli estraendo subunità di tubulina dal reticolo. La spastina contribuisce al mantenimento degli assoni, al traffico endosomiale e del reticolo endoplasmatico (RE) e agli eventi di fissione di membrana, integrandosi con le dinamiche del citoscheletro che modellano la crescita dei neuriti e il trasporto intracellulare. Attraverso questi ruoli, **SPAST** influenza vie che regolano la distribuzione degli organelli e la connettività neuronale nei neuroni a lunga proiezione. La disregolazione o la perdita dell’attività della spastina è fortemente associata alla paraplegia spastica ereditaria ed è spesso studiata in modelli di assonopatia e di difetti di traffico legati alla neurodegenerazione.

Spastin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SPAST senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Spastin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SPAST nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SPAST, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Spastin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SPAST nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Spastin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Spastin nelle cellule tumorali con espressione di SPAST silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.