Sp8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401546-ACT

SP8 codifica il fattore di trascrizione Sp8 a dita di zinco, che si lega a elementi regolatori ricchi in GC per controllare programmi di espressione genica durante lo sviluppo embrionale umano. È implicato in processi di patterning e differenziamento, inclusi lo sviluppo del neuroectoderma e craniofacciale, coordinando reti trascrizionali che si interfacciano con segnali guidati da morfogeni come WNT/β-catenina e altre vie di sviluppo correlate. Un’alterata attività di SP8 o la disregolazione delle reti dei geni bersaglio è stata associata a fenotipi di malformazioni congenite e a una regolazione anomala dei geni dello sviluppo, rendendolo rilevante per studi sulla specificazione di linea e sulla morfogenesi. In quanto regolatore nucleare che si lega al DNA, Sp8 è spesso usato come nodo per mappare circuiti trascrizionali e il controllo enhancer-promoter in sistemi in differenziamento.

Sp8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SP8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Sp8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SP8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SP8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Sp8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SP8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Sp8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Sp8 nelle cellule tumorali con espressione di SP8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.