SMC4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405067-ACT

SMC4 codifica un’ATPasi fondamentale del complesso di mantenimento strutturale dei cromosomi che, insieme a SMC2, costituisce l’impalcatura catalitica dei complessi di condensina necessari per la condensazione dei cromosomi in mitosi, la risoluzione delle cromatidi sorelle e la corretta segregazione cromosomica. Attraverso l’estrusione di anse di DNA dipendente da ATP e l’organizzazione della cromatina di ordine superiore, SMC4 sostiene le dinamiche della cromatina associate alla replicazione, il coordinamento della risposta al danno al DNA e il mantenimento della stabilità del genoma. Un’espressione o una funzione disregolata di SMC4 è stata associata a instabilità cromosomica e a fenotipi di proliferazione aberrante osservati in molteplici contesti tumorali, rendendola un nodo utile per studiare l’aneuploidia e il controllo dei checkpoint del ciclo cellulare. Inoltre, l’architettura della cromatina dipendente da SMC4 influenza programmi trascrizionali legati alla mitosi e alle risposte allo stress, fornendo un collegamento meccanicistico tra struttura dei cromosomi e regolazione genica.

SMC4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SMC4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SMC4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SMC4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SMC4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SMC4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SMC4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SMC4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SMC4 nelle cellule tumorali con espressione di SMC4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.