SLAIN2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-429242-ACT

Slain2 codifica SLAIN2, un adattatore che segue l’estremità “plus” dei microtubuli e coopera con le proteine EB e con il complesso ch-TOG/XMAP215 per promuovere una crescita persistente dei microtubuli e coordinare l’organizzazione del citoscheletro. Regolando la dinamica dei microtubuli, SLAIN2 influenza il trasporto intracellulare, la polarità cellulare e la funzione del fuso mitotico, processi centrali per la morfogenesi neuronale e il controllo della proliferazione. L’alterazione delle reti di regolazione dei microtubuli può compromettere la crescita degli assoni e la connettività sinaptica e può inoltre incidere sulla stabilità cromosomica tramite una modifica dell’assemblaggio del fuso. Nella ricerca biomedica sul topo, Slain2 rappresenta un punto d’ingresso maneggevole per studiare come la regolazione dell’estremità plus dei microtubuli si interfacci con la progressione del ciclo cellulare e con i programmi di differenziamento.

SLAIN2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Slain2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SLAIN2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Slain2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Slain2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SLAIN2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Slain2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SLAIN2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SLAIN2 nelle cellule tumorali con espressione di Slain2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.