SK1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403325-ACT

KCNN1 codifica il canale umano del potassio SK1 a piccola conduttanza attivato dal Ca2+, un canale indipendente dal voltaggio che collega le dinamiche intracellulari del Ca2+ all’iperpolarizzazione di membrana. Modellando l’afterhyperpolarization e i microdomini di segnalazione del Ca2+, SK1 influenza l’eccitabilità neuronale, l’integrazione sinaptica e l’accoppiamento stimolo-secrezione nelle cellule eccitabili. L’attività di KCNN1 si interseca con processi Ca2+/calmodulina-dipendenti che regolano i pattern di scarica, la plasticità e le risposte trascrizionali a valle. Alterazioni della funzione e dell’espressione dei canali SK sono state studiate nel contesto della disregolazione neurofisiologica e di fenotipi rilevanti per la malattia, a supporto della sua utilità per studi meccanicistici delle vie legate all’eccitabilità.

SK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCNN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCNN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCNN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SK1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCNN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SK1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SK1 nelle cellule tumorali con espressione di KCNN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.