serum reponse factor /SRF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400470-ACT

L’SRF (serum response factor) umano è un fattore di trascrizione della famiglia MADS-box che si lega agli elementi di risposta al siero (SRE) per coordinare programmi di espressione dei geni immediati-precoci in risposta a fattori di crescita, mitogeni e segnali/meccanocues di natura meccanica. Integra la segnalazione mediata dalla dinamica RhoA–actina tramite i cofattori MRTF e le vie MAPK/ERK tramite i ternary complex factors, regolando così l’organizzazione del citoscheletro, l’adesione cellulare, la migrazione e la differenziazione miogenica. Le reti trascrizionali dipendenti da SRF modellano l’espressione genica del muscolo liscio e cardiaco e, più in generale, processi di rimodellamento sensibili allo stress. Un’attività di SRF deregolata è stata associata a segnali proliferativi aberranti, motilità alterata e rimodellamento tissutale patologico, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici dei circuiti di regolazione genica.

serum reponse factor /SRF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SRF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

serum reponse factor /SRF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SRF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SRF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di serum reponse factor /SRF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SRF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da serum reponse factor /SRF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via serum reponse factor /SRF nelle cellule tumorali con espressione di SRF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.