SAP 155 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402925-ACT

SF3B1 codifica SAP155, un componente centrale del sottocomplesso SF3b all’interno della snRNP U2, indispensabile per il riconoscimento del punto di ramificazione e la corretta rimozione degli introni durante lo splicing del pre‑mRNA. Favorendo l’assemblaggio e la stabilizzazione dello spliceosoma sul sito di splicing 3′, SAP155 influenza programmi di splicing alternativo che modellano la diversità del proteoma e coordinano l’elaborazione dell’RNA con la regolazione trascrizionale. L’alterazione della selezione dei siti di splicing dipendente da SF3B1 compromette la maturazione dell’RNA e può modificare l’espressione di vie che controllano la progressione del ciclo cellulare, le risposte al danno del DNA e la differenziazione. SF3B1 è spesso studiato nel contesto della biologia dello spliceosoma e degli errori di splicing associati a malattia, in cui varianti codificanti ricorrenti sono collegate a un’ampia splicing aberrante e a una riorganizzazione del trascrittoma.

SAP 155 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SF3B1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SAP 155 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SF3B1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SF3B1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SAP 155. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SF3B1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SAP 155 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SAP 155 nelle cellule tumorali con espressione di SF3B1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.