RNF123 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403631-ACT

RNF123 (noto anche come KPC1) codifica una ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo RING che contribuisce al controllo dell’omeostasi proteica catalizzando la degradazione, dipendente dall’ubiquitina, di specifici substrati. È stato implicato nella regolazione della progressione del ciclo cellulare attraverso il processamento mediato dall’ubiquitina di CDKN1B/p27 e dei relativi circuiti di checkpoint, collegando l’attività di RNF123 ai programmi di proliferazione e risposta allo stress. Come parte del sistema ubiquitina–proteasoma, RNF123 influenza gli output di segnalazione modulando la stabilità di proteine regolatorie che governano crescita e differenziamento. Le vie di ubiquitinazione deregolate che coinvolgono RNF123 sono quindi di interesse negli studi sulla segnalazione oncogenica, sulla stabilità del genoma e sui meccanismi di malattia associati alla proteostasi.

RNF123 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RNF123 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RNF123 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RNF123 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RNF123, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RNF123. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RNF123 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RNF123 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RNF123 nelle cellule tumorali con espressione di RNF123 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.