RKIP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401270-ACT

Il gene umano PEBP1 codifica la Raf kinase inhibitory protein (RKIP), un modulatore conservato della trasduzione del segnale che frena la segnalazione RAF1–MEK–ERK e può influenzare le vie dei GPCR tramite l’inibizione di GRK2. Modellando la dinamica della segnalazione mediata da chinasi, RKIP contribuisce alla regolazione di proliferazione, differenziamento, risposte allo stress e programmi apoptotici, ed è stata collegata alla motilità cellulare e alla transizione epitelio–mesenchimale tramite cross-talk con reti associate a MAPK e NF-κB. Un’espressione deregolata di PEBP1/RKIP è stata riportata in molteplici contesti rilevanti per la patologia, inclusi la biologia dei tumori e la segnalazione infiammatoria, in cui un’alterata capacità di “buffering” delle vie può influenzare il comportamento invasivo e i fenotipi di risposta alle terapie. Queste caratteristiche rendono PEBP1 un nodo utile per analizzare feedback di via, riscrittura delle reti di chinasi e output trascrizionali dipendenti dal contesto in modelli di cellule umane.

RKIP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PEBP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RKIP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PEBP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PEBP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RKIP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PEBP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RKIP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RKIP nelle cellule tumorali con espressione di PEBP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.