RIG-I Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400812-ACT

DDX58 codifica per l’elicasi di RNA citosolica RIG-I, un recettore chiave di riconoscimento dei pattern (pattern-recognition receptor, PRR) che rileva RNA virale a doppio filamento corto e RNA con estremità 5′-trifosfato. Dopo il legame con il ligando, RIG-I trasmette il segnale attraverso MAVS attivando le vie di IRF3/IRF7 e di NF-κB, inducendo interferoni di tipo I e citochine proinfiammatorie come parte della difesa antivirale dell’immunità innata. Questo asse si integra con programmi più ampi di geni stimolati dall’interferone, con il rimodellamento immunometabolico e con il crosstalk con autofagia e apoptosi durante lo stress cellulare. Una segnalazione di RIG-I deregolata è stata associata ad alterazioni della risposta antivirale e a fenotipi infiammatori rilevanti per la biologia delle infezioni e per i meccanismi delle malattie immuno-mediate.

RIG-I Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DDX58 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RIG-I Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DDX58 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DDX58, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RIG-I. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DDX58 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RIG-I nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RIG-I nelle cellule tumorali con espressione di DDX58 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.