RBP2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403940-ACT

KDM5A codifica RBP2, una demetilasi delle lisine istoniche contenente un dominio JmjC che rimuove preferenzialmente i segni H3K4me3/me2 per regolare l’attività dei promotori e l’output trascrizionale. Modellando l’accessibilità della cromatina e i programmi di espressione genica dipendenti dalla RNA polimerasi II, RBP2 influenza la progressione del ciclo cellulare, la specificazione di linea e le risposte a segnali di sviluppo e di stress. La sua attività si integra con reti di controllo epigenetico che coinvolgono la regolazione enhancer–promotore e l’occupazione da parte dei fattori di trascrizione. Una funzione deregolata di KDM5A/RBP2 è stata associata a stati trascrizionali aberranti osservati in molteplici contesti rilevanti per la malattia, inclusi la biologia del cancro e fenotipi neuroevolutivi, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici della regolazione genica guidata dalla cromatina.

RBP2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KDM5A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RBP2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KDM5A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KDM5A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RBP2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KDM5A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RBP2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RBP2 nelle cellule tumorali con espressione di KDM5A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.