RBKS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404754-ACT

RBKS (ribochinasi) codifica una chinasi dei carboidrati citosolica che fosforila il D-ribosio a ribosio-5-fosfato, collegando la via di recupero del ribosio alla via dei pentoso fosfati e alla biosintesi dei nucleotidi. Regolando i pool intracellulari di ribosio-5-fosfato, RBKS influenza il metabolismo delle purine e delle pirimidine, il bilanciamento redox tramite reazioni che generano NADPH e la capacità proliferativa nelle cellule metabolicamente attive. L’attività di RBKS si integra con un controllo più ampio dei flussi di carbonio che sostiene la sintesi di DNA/RNA e le risposte allo stress cellulare. La disregolazione del metabolismo del ribosio e il rimodellamento della via dei pentoso fosfati sono spesso studiati nel contesto del metabolismo tumorale, dell’attivazione delle cellule immunitarie e di errori congeniti che alterano l’omeostasi dei nucleotidi.

RBKS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RBKS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RBKS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RBKS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RBKS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RBKS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RBKS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RBKS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RBKS nelle cellule tumorali con espressione di RBKS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.