RB1CC1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419502-ACT

Rb1cc1 codifica RB1CC1 (nota anche come FIP200), un componente fondamentale del complesso ULK1 che avvia l’autofagia e coordina la formazione degli autofagosomi in risposta allo stato nutrizionale e allo stress cellulare. RB1CC1 interagisce inoltre con la segnalazione di mTOR e AMPK per collegare le vie dipendenti dai fattori di crescita e dal sensing energetico al flusso autofagico, influenzando il controllo di qualità mitocondriale e la proteostasi. Attraverso queste funzioni, RB1CC1 influisce sulla sopravvivenza cellulare, sull’infiammazione e sull’omeostasi tissutale, ed è quindi ampiamente studiata in ambiti quali neurodegenerazione, disregolazione metabolica e biologia dei tumori. Nei modelli murini, la modulazione di RB1CC1 offre uno strumento meccanicistico per indagare i programmi di adattamento allo stress e il rimodellamento dipendente dall’autofagia in diversi tipi cellulari.

RB1CC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Rb1cc1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RB1CC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Rb1cc1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Rb1cc1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RB1CC1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Rb1cc1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RB1CC1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RB1CC1 nelle cellule tumorali con espressione di Rb1cc1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.