PYK2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400708-ACT

PTK2B codifica la tirosin-chinasi non recettoriale PYK2 (protein tyrosine kinase 2 beta), un nodo di segnalazione sensibile a Ca2+ e alle integrine che collega gli stimoli extracellulari al rimodellamento del citoscheletro e all’espressione genica. PYK2 partecipa alle vie delle adesioni focali e alla dinamica dell’actina e interagisce con le chinasi della famiglia Src, con la segnalazione MAPK/ERK e con programmi trascrizionali a valle che regolano adesione, migrazione e risposte infiammatorie. Nelle linee immunitarie e mieloidi, PYK2 modula la segnalazione indotta da chemochine e citochine e contribuisce all’attivazione dell’immunità innata e al traffico leucocitario. La deregolazione della segnalazione PTK2B/PYK2 è stata implicata in meccanismi neuroinfiammatori e neurodegenerativi, in reti di segnalazione associate all’autoimmunità e in contesti di invasione delle cellule tumorali, rendendola un bersaglio utile per studi di perturbazione delle vie di segnalazione.

PYK2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PTK2B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PYK2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PTK2B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PTK2B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PYK2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PTK2B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PYK2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PYK2 nelle cellule tumorali con espressione di PTK2B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.