PSS2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424258-ACT

Il gene murino *Ptdss2* codifica la fosfatidilserina sintasi 2 (PSS2), un enzima di membrana del reticolo endoplasmatico che catalizza la produzione di fosfatidilserina (PS) tramite scambio di basi utilizzando la fosfatidiletanolamina. Regolando i pool cellulari di PS, PSS2 contribuisce alla biogenesi delle membrane, all’omeostasi lipidica e alla funzione degli organelli, con effetti a valle su processi quali il traffico vescicolare, la fisiologia mitocondriale e la segnalazione legata all’apoptosi, in cui la distribuzione della PS è cruciale. L’alterazione della biosintesi di PS può modificare la composizione di membrana e le reti di segnalazione associate all’adattamento metabolico e alle risposte allo stress, rendendo la regolazione di *Ptdss2* rilevante per studi meccanicistici su fenotipi cellulari dipendenti dai lipidi. In quanto nodo centrale del metabolismo dei glicerofosfolipidi, PSS2 offre un punto di accesso agevole per indagare come la composizione lipidica delle membrane influenzi lo stato cellulare e vie associate alla malattia.

PSS2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ptdss2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PSS2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ptdss2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ptdss2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PSS2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ptdss2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PSS2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PSS2 nelle cellule tumorali con espressione di Ptdss2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.