PSMD3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405946-ACT

PSMD3 codifica una subunità non ATPasica della particella regolatoria 19S del proteasoma 26S, contribuendo al riconoscimento e alla processazione delle proteine in modo dipendente dall’ubiquitina prima della loro degradazione. Sostenendo la funzione del proteasoma, PSMD3 influenza la proteostasi cellulare, la progressione del ciclo cellulare, le risposte allo stress e i processi di presentazione dell’antigene che dipendono dal ricambio regolato di proteine chiave della segnalazione. Un’attività proteasomiale deregolata e un’alterata espressione di PSMD3 sono state associate, in diversi contesti, a segnali infiammatori aberranti e a programmi oncogenici, riflettendo il ruolo centrale del proteasoma nel controllo della stabilità di fattori di trascrizione e proteine dei checkpoint. Di conseguenza, PSMD3 rappresenta un bersaglio utile per studi meccanicistici sulla dinamica del sistema ubiquitina–proteasoma e sul rimodellamento delle vie di segnalazione a valle.

PSMD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PSMD3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PSMD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PSMD3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PSMD3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PSMD3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PSMD3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PSMD3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PSMD3 nelle cellule tumorali con espressione di PSMD3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.