PRX IV Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402821-ACT

La perossiredossina 4 (PRDX4; PRX IV) è una perossidasi tiolo-dipendente localizzata principalmente nel reticolo endoplasmatico e nella via secretoria, dove catalizza la riduzione del perossido di idrogeno e degli idroperossidi organici per mantenere l’omeostasi redox. Accoppiando la detossificazione dei perossidi al ripiegamento ossidativo delle proteine, PRX IV si integra con le risposte allo stress del RE e con la segnalazione della risposta alle proteine mal ripiegate (UPR), influenzando la proteostasi, la secrezione e la sopravvivenza cellulare in condizioni ossidative. Un’attività alterata di PRDX4 è stata associata a una deregolazione della segnalazione redox nell’infiammazione e nello stress metabolico, ed è spesso studiata in contesti in cui lo stress ossidativo modella la biologia tumorale, la funzione delle cellule immunitarie e la fisiologia dei tessuti secretori. In quanto regolatore redox, PRX IV interagisce anche con nodi di segnalazione mediati dai perossidi che modulano vie chinasi e programmi trascrizionali legati all’adattamento cellulare.

PRX IV Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRDX4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PRX IV Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRDX4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRDX4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PRX IV. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRDX4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PRX IV nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PRX IV nelle cellule tumorali con espressione di PRDX4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.