Pr-Set7 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-415759-ACT

KMT5A codifica Pr-Set7 (SETD8), una metiltransferasi della lisina contenente un dominio SET che catalizza la monometilazione dell’istone H4 in corrispondenza della lisina 20 (H4K20me1), un segno cromatinico associato alla maturazione dei nucleosomi accoppiata alla replicazione e all’integrità del genoma. L’attività di Pr-Set7 coordina la progressione del ciclo cellulare, la concessione della licenza di replicazione del DNA e le risposte al danno al DNA regolando la compattazione della cromatina e il reclutamento dei fattori di riparazione. Un’espressione o un’attività deregolata di KMT5A/Pr-Set7 è stata associata ad assetti epigenetici alterati, stress replicativo e fenotipi proliferativi riportati in molteplici contesti tumorali. In quanto enzima della cromatina al crocevia tra controllo epigenetico e segnalazione dei checkpoint, KMT5A è ampiamente studiato nella regolazione trascrizionale, nel crosstalk tra vie di riparazione del DNA e nella dinamica della cromatina.

Pr-Set7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KMT5A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pr-Set7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KMT5A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KMT5A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pr-Set7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KMT5A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pr-Set7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pr-Set7 nelle cellule tumorali con espressione di KMT5A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.