PPP1R15B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408988-ACT

PPP1R15B (nota anche come CReP) codifica una subunità regolatoria che indirizza la fosfatasi proteica 1 (PP1) a defosforilare eIF2α, agendo come un contrappeso chiave alla repressione della traduzione indotta dallo stress. Promuovendo la defosforilazione di eIF2α, PPP1R15B contribuisce a ripristinare la sintesi proteica globale dopo perturbazioni e modula la segnalazione della risposta integrata allo stress (ISR), che si interseca con lo stress del RE, la proteostasi e i programmi di sopravvivenza cellulare. Questo controllo mediato da PP1 influenza le vie di adattamento trascrizionale e metabolico a valle, governate da reti dipendenti da ATF4/CHOP. La disregolazione della dinamica di fosforilazione di eIF2α e della modulazione dell’ISR è stata implicata in diversi contesti, tra cui neurodegenerazione, stress metabolico e adattamento delle cellule tumorali, rendendo PPP1R15B un nodo utile per studi meccanicistici della resilienza allo stress.

PPP1R15B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPP1R15B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PPP1R15B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPP1R15B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPP1R15B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PPP1R15B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPP1R15B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PPP1R15B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PPP1R15B nelle cellule tumorali con espressione di PPP1R15B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.