PP2A-Aα Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400876-ACT

PPP2R1A codifica la subunità di impalcatura Aα della protein fosfatasi 2A (PP2A), una delle principali fosfatasi Ser/Thr, che assembla subunità catalitiche e regolatorie per determinare la specificità di substrato e la localizzazione subcellulare. PP2A-Aα coordina la defosforilazione nelle principali reti di segnalazione, tra cui MAPK/ERK, PI3K–AKT–mTOR, Wnt/β-catenina e il controllo dei checkpoint del ciclo cellulare, influenzando così proliferazione, differenziamento e risposte allo stress. Alterazioni della funzione di PPP2R1A o della composizione dell’oloenzima PP2A sono associate a una disregolazione dell’omeostasi della fosforilazione e a instabilità genomica, e varianti di PPP2R1A sono ricorrentemente collegate a molteplici tipi di tumore. Questo gene è spesso studiato nel contesto della regolazione mitotica, della segnalazione del danno al DNA e della modulazione, mediata da fosfatasi, di vie oncogeniche.

PP2A-Aα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPP2R1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PP2A-Aα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPP2R1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPP2R1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PP2A-Aα. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPP2R1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PP2A-Aα nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PP2A-Aα nelle cellule tumorali con espressione di PPP2R1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.