podoplanin Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420632-ACT

Il gene murino Pdpn codifica la podoplanina, una glicoproteina transmembrana di tipo mucinico espressa nelle cellule endoteliali linfatiche, nelle cellule reticolari fibroblastiche e in specifici compartimenti epiteliali, dove regola la forma cellulare, l’adesione e la motilità direzionale. La podoplanina interagisce con il recettore piastrinico CLEC-2 influenzando il rimodellamento del citoscheletro tramite la segnalazione RhoA/ROCK e coordina la dinamica dell’actina, importante per la linfangiogenesi, l’organizzazione dei tessuti e la formazione delle reti stromali. Nel microambiente tumorale, cellule stromali e tumorali PDPN-positive sono state associate a comportamento invasivo, rimodellamento della matrice extracellulare e alterazioni del traffico delle cellule immunitarie. Un’espressione disregolata di PDPN è inoltre collegata a rimodellamento infiammatorio e a vie rilevanti per la fibrosi, rendendola un bersaglio utile per studi meccanicistici della biologia vascolare e stromale.

podoplanin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Pdpn senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

podoplanin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Pdpn nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Pdpn, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di podoplanin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Pdpn nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da podoplanin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via podoplanin nelle cellule tumorali con espressione di Pdpn silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.