PNUTS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403688-ACT

PPP1R10 codifica PNUTS (subunità regolatoria 10 della protein fosfatasi 1), una subunità con targeting nucleare che si lega a PP1 e modula l’attività fosfatasica su substrati associati alla cromatina. PNUTS partecipa al controllo trascrizionale, alla segnalazione della risposta al danno al DNA e alla progressione del ciclo cellulare coordinando la defosforilazione proteica con le vie di mantenimento del genoma. È stata collegata alla regolazione della trascrizione dipendente dall’RNA polimerasi II e a processi che influenzano la stabilità dei telomeri e lo stress replicativo. Un’alterazione dell’attività di PPP1R10/PNUTS è stata associata a proliferazione deregolata e a fenotipi di instabilità genomica rilevanti per la biologia del cancro e per altri disturbi che coinvolgono difetti nella riparazione del DNA e nella segnalazione nucleare.

PNUTS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPP1R10 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PNUTS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPP1R10 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPP1R10, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PNUTS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPP1R10 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PNUTS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PNUTS nelle cellule tumorali con espressione di PPP1R10 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.