PMCA4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402888-ACT

ATP2B4 codifica la Ca2+-ATPasi 4 della membrana plasmatica (PMCA4), una ATPasi di tipo P ad alta affinità che esporta il Ca2+ citosolico per mantenere l’omeostasi del calcio e modulare i segnali di Ca2+ nello spazio e nel tempo. Regolando finemente la dinamica intracellulare del Ca2+, PMCA4 influenza l’accoppiamento eccitazione–contrazione, la segnalazione dell’ossido nitrico tramite la sua prossimità alla sintasi endoteliale dell’ossido nitrico, e i programmi trascrizionali a valle controllati da vie sensibili al Ca2+ come calcineurina–NFAT e la segnalazione CaMK. L’attività di PMCA4 contribuisce alla regolazione del potenziale di membrana, della migrazione cellulare e della suscettibilità all’apoptosi attraverso il controllo di enzimi e canali ionici Ca2+-dipendenti. Un’espressione o una funzione disregolata di ATP2B4/PMCA4 è stata collegata, in studi genetici e meccanicistici, a fenotipi cardiovascolari ed eritroidi, a supporto della sua rilevanza per modellare la biologia guidata dal Ca2+ nelle cellule umane.

PMCA4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP2B4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PMCA4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP2B4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP2B4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PMCA4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP2B4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PMCA4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PMCA4 nelle cellule tumorali con espressione di ATP2B4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.