Pim-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401715-ACT

PIM2 codifica Pim-2, una chinasi serina/treonina costitutivamente attiva che integra i segnali provenienti da citochine e fattori di crescita per promuovere la sopravvivenza cellulare, la proliferazione e l’adattamento metabolico. Pim-2 fosforila regolatori della segnalazione e dell’apoptosi, sostenendo il controllo della traduzione e la resistenza allo stress cellulare, e interseca funzionalmente programmi associati a JAK/STAT, PI3K/AKT/mTOR e NF-κB. Un’espressione o un’attività di PIM2 deregolate sono state collegate ad alterazioni dell’omeostasi delle cellule ematopoietiche e a reti di segnalazione oncogeniche, in particolare in contesti in cui le vie di sopravvivenza sono attivate in modo persistente. In quanto modulatore di checkpoint dipendenti dalla fosforilazione, Pim-2 è spesso studiata per i suoi effetti su apoptosi, progressione del ciclo cellulare e fenotipi di risposta alle terapie in sistemi modello.

Pim-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PIM2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pim-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PIM2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PIM2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pim-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PIM2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pim-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pim-2 nelle cellule tumorali con espressione di PIM2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.