PHD3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-431083-ACT

Egln3 nel topo codifica la proteina 3 contenente il dominio prolil-idrossilasi (PHD3), un enzima sensore dell’ossigeno che idrossila le subunità HIF-α e ne promuove l’ubiquitinazione dipendente da VHL e la successiva degradazione proteasomiale. Attraverso la regolazione dei programmi trascrizionali mediati da HIF, PHD3 influenza vie di risposta all’ipossia che controllano angiogenesi, adattamento metabolico, eritropoiesi e segnalazione infiammatoria. L’attività di Egln3 interseca anche processi di risposta allo stress e apoptosi, contribuendo alle decisioni sul destino cellulare in condizioni di limitazione di nutrienti o ossigeno. Una segnalazione deregolata dell’asse PHD3/HIF è implicata in fenotipi guidati dall’ipossia rilevanti per la biologia tumorale, modelli di danno ischemico e meccanismi di malattie infiammatorie croniche, rendendo Egln3 un nodo utile per l’analisi delle vie di segnalazione in vivo e in colture di cellule murine.

HIF PHD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Egln3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HIF PHD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Egln3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Egln3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HIF PHD3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Egln3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HIF PHD3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HIF PHD3 nelle cellule tumorali con espressione di Egln3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.