PACE4 Particelle di Attivazione Lentivirale (h2): sc-405605-LAC-2

Il gene umano PCSK6 codifica la proprotein convertasi PACE4, una serina endoproteasi calcio-dipendente che processa proteine precursori secrete e di superficie cellulare in corrispondenza di motivi con residui basici, generando fattori maturi e bioattivi. PACE4 contribuisce all’attivazione post-traduzionale di fattori di crescita, metalloproteinasi, recettori e proteine legate all’adesione, collegando l’attività di PCSK6 al rimodellamento della matrice extracellulare, alla migrazione cellulare e a reti di segnalazione dello sviluppo, incluse vie associate a TGF-β/BMP. Un’espressione o un’attività deregolata di PCSK6 è stata associata a un processamento proteolitico aberrante nella biologia dei tumori, nel rimodellamento tissutale legato alla fibrosi e in fenotipi cardiovascolari, a testimonianza del suo ruolo nella regolazione della segnalazione paracrina e delle cascate proteasiche. La perturbazione di PCSK6/PACE4 viene quindi utilizzata in studi di gene editing e di genomica funzionale per indagare la maturazione dei substrati dipendente dalle convertasi, la proteostasi della via secretoria e le conseguenti variazioni a valle in invasività, differenziamento e segnali infiammatori.

Le particelle di attivazione lentivirale PACE4 (h2) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di PCSK6 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale PACE4 (h2) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione PCSK6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di PACE4. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo PCSK6 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.