p54/nrb Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-424729-LAC

Il gene **Nono** del topo codifica p54/nrb (NONO), una proteina nucleare multifunzionale legante RNA e DNA della famiglia DBHS che forma eterodimeri con SFPQ/PSPC1 per organizzare i paraspeckle e coordinare trascrizione, splicing del pre‑mRNA e ritenzione dell’RNA. p54/nrb partecipa alla risposta e alla riparazione del danno al DNA, inclusi ruoli nel non-homologous end joining, e contribuisce ad accoppiare la trascrizione dipendente da segnali con il processamento dell’RNA attraverso interazioni con complessi associati alla RNA polimerasi II. Tramite la regolazione di programmi di espressione genica che controllano progressione del ciclo cellulare, differenziamento e risposte allo stress, un’attività alterata di NONO è stata collegata a instabilità genomica e a reti trascrizionali aberranti rilevanti per il cancro e per fenotipi neuroevolutivi. In quanto scaffold per assemblaggi ribonucleoproteici, p54/nrb influenza anche la dinamica dei corpi nucleari e la regolazione mediata da RNA lunghi non codificanti, rendendola un bersaglio utile per studi meccanicistici dell’organizzazione nucleare.

Le particelle di attivazione lentivirale p54/nrb (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Nono in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale p54/nrb (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Nono, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di p54/nrb. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Nono e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.