p53 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423509-ACT

Il gene murino Trp53 codifica il fattore di trascrizione p53, un regolatore centrale dell’integrità del genoma che integra danni al DNA, stress oncogeno e segnali metabolici per coordinare arresto del ciclo cellulare, senescenza, apoptosi e riparazione del DNA. L’attività di p53 interseca la segnalazione ATM/ATR–CHK, il circuito di feedback negativo mediato da MDM2 e le vie che controllano lo stress ossidativo e l’omeostasi mitocondriale. L’alterazione o l’attenuazione della segnalazione di p53 è ampiamente rilevante per la biologia tumorale e influenza gli esiti sperimentali negli studi sullo stress genotossico, sulla regolazione della cromatina e sui programmi genici immunomodulatori. Nei sistemi modello murini, la modulazione dell’espressione di Trp53 è comunemente utilizzata per indagare i meccanismi di adattamento allo stress e i fenotipi associati alla trasformazione.

p53 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Trp53 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p53 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Trp53 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Trp53, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p53. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Trp53 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p53 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p53 nelle cellule tumorali con espressione di Trp53 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.