p41-ARCb Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419207-ACT

Arpc1b codifica p41-ARCb, una subunità del complesso ARP2/3 che promuove la nucleazione e la ramificazione dell’actina, necessarie per il rimodellamento dinamico del citoscheletro nelle cellule murine. Favorendo la formazione dei lamellipodi, l’endocitosi e il traffico vescicolare, p41-ARCb contribuisce a processi quali la migrazione delle cellule immunitarie, la fagocitosi e la segnalazione dipendente dall’adesione. Le reti di actina guidate da ARP2/3 si interfacciano con le vie delle GTPasi della famiglia Rho e con i regolatori a valle della polarità e della motilità cellulare. La disregolazione dell’assemblaggio dell’actina associato ad ARPC1B è collegata ad alterazioni della funzione immunitaria e a fenotipi infiammatori, rendendola rilevante per lo studio del contributo del citoscheletro alla difesa dell’ospite e all’omeostasi tissutale.

p41-ARCb Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Arpc1b senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p41-ARCb Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Arpc1b nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Arpc1b, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p41-ARCb. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Arpc1b nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p41-ARCb nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p41-ARCb nelle cellule tumorali con espressione di Arpc1b silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.