p300 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400055-ACT

EP300 umano codifica p300, una lisina acetiltransferasi e coattivatore trascrizionale che integra segnali provenienti da molteplici fattori di trascrizione per regolare l’accessibilità della cromatina e l’espressione genica. p300 acetila istoni e proteine non istoniche, modulando l’attività degli enhancer e controllando programmi coinvolti nella progressione del ciclo cellulare, nella differenziazione, nelle risposte al danno al DNA e nella segnalazione dello stress. EP300 partecipa a vie di segnalazione collegate a MAPK/ERK, TGF-β/SMAD, ipossia (HIF) e alla regolazione trascrizionale mediata da p53 attraverso ampie reti di interazioni proteina–proteina. La disregolazione dell’acetilazione e del controllo trascrizionale dipendenti da EP300/p300 è associata ad alterazioni della specificazione di linea e a stati trascrizionali aberranti osservati in diversi modelli di malattia.

p300 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EP300 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p300 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EP300 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EP300, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p300. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EP300 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p300 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p300 nelle cellule tumorali con espressione di EP300 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.