P2X4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401779-ACT

Il gene umano **P2RX4** codifica il canale cationico **P2X4** attivato dall’ATP, un recettore purinergico trimerico che media un rapido ingresso di **Ca²⁺** e **Na⁺** in risposta ai nucleotidi extracellulari. La segnalazione di P2X4 si integra con la neurotrasmissione purinergica, l’omeostasi ionica e il rilevamento di segnali infiammatori, influenzando l’attivazione della microglia, il rilascio di citochine e la comunicazione neuro-immune. Attraverso i suoi ruoli nel traffico endolisosomiale, nell’eccitabilità di membrana e nelle cascate di segnalazione calcio-dipendenti, P2X4 contribuisce alla regolazione della plasticità sinaptica e della funzione vascolare e delle cellule immunitarie. Un’attività deregolata di P2RX4/P2X4 è stata associata a meccanismi del dolore cronico, neuroinfiammazione e fenotipi cardiovascolari e immuno-correlati, rendendolo rilevante per studi a livello di via di segnalazione guidati dall’ATP.

P2X4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di P2RX4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

P2X4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus P2RX4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione P2RX4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di P2X4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus P2RX4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da P2X4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via P2X4 nelle cellule tumorali con espressione di P2RX4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.