P2P-R Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404165-ACT

Il gene umano RBBP6 codifica la proteina P2P-R, un fattore multidominio che si associa a p53 e ai componenti della via del retinoblastoma per influenzare la progressione del ciclo cellulare, l’apoptosi e il controllo della trascrizione. RBBP6 contiene motivi compatibili con ruoli nella regolazione proteica dipendente dall’ubiquitina e nel processamento dell’RNA, collegandolo alla proteostasi e ai programmi di maturazione dell’mRNA che coordinano la proliferazione. Un’alterata attività di RBBP6 è stata riportata in diversi contesti della biologia tumorale, in cui sono comuni perturbazioni della segnalazione p53/RB e del controllo dei checkpoint, rendendolo rilevante per studi meccanicistici delle risposte allo stress oncogenico. Nei modelli cellulari, la modulazione dei livelli di P2P-R può essere utilizzata per indagare il crosstalk tra la segnalazione del danno al DNA, la regolazione trascrizionale e il metabolismo post-trascrizionale dell’RNA.

P2P-R Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RBBP6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

P2P-R Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RBBP6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RBBP6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di P2P-R. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RBBP6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da P2P-R nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via P2P-R nelle cellule tumorali con espressione di RBBP6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.