ORP-8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405318-ACT

OSBPL8 codifica la oxysterol-binding protein–related protein 8 (ORP-8), un fattore di trasferimento lipidico e di rilevamento degli steroli che contribuisce a coordinare la distribuzione cellulare di colesterolo e fosfolipidi nei siti di contatto tra membrane, in particolare tra il reticolo endoplasmatico e altri organelli. ORP-8 partecipa alla regolazione del metabolismo lipidico, della composizione di membrana e di processi di segnalazione legati alla gestione dei fosfoinositidi e al traffico vescicolare, contribuendo all’omeostasi cellulare in condizioni variabili di nutrienti o di stress. Un’alterazione dell’attività di ORP-8 è stata studiata in contesti che coinvolgono una gestione lipidica disfunzionale e la segnalazione infiammatoria, frequentemente implicate nella biologia delle malattie metaboliche e cardiovascolari, nonché nel rimodellamento metabolico associato ai tumori. Nei modelli cellulari umani, la modulazione di ORP-8 è quindi rilevante per analizzare il crosstalk tra vie guidate dai lipidi che influenza proliferazione, risposte allo stress e comunicazione tra organelli.

ORP-8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di OSBPL8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ORP-8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus OSBPL8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione OSBPL8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ORP-8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus OSBPL8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ORP-8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ORP-8 nelle cellule tumorali con espressione di OSBPL8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.