OR2A1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417340-ACT

OR2A1 umano codifica un recettore olfattivo della famiglia dei GPCR di classe A che si accoppia alla segnalazione della proteina G olfattiva per regolare la trasduzione sensoriale evocata dagli odoranti. In seguito al legame con il ligando, OR2A1 in genere attiva le vie adenilato ciclasi–cAMP per modulare l’attività dei canali ionici regolati da nucleotidi ciclici e i programmi a valle di eccitabilità neuronale. Sebbene sia stato caratterizzato soprattutto nell’epitelio olfattivo, trascritti di recettori olfattivi sono stati riportati in diversi tessuti periferici, stimolando studi sulla segnalazione GPCR ectopica e sulla regolazione trascrizionale dipendente dal contesto. Pattern di espressione alterati tra tessuti e stati patologici hanno reso OR2A1 un gene marcatore utile per indagare la regolazione genica dei GPCR sensoriali e fenotipi correlati alla chemosensibilità in modelli cellulari.

OR2A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di OR2A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

OR2A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus OR2A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione OR2A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di OR2A1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus OR2A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da OR2A1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via OR2A1 nelle cellule tumorali con espressione di OR2A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.