Optineurin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401851-ACT

OPTN codifica per optineurina, una proteina adattatrice multifunzionale che coordina l’autofagia selettiva, il traffico vescicolare e la segnalazione dell’immunità innata. L’optineurina lega carichi ubiquitinati e componenti del macchinario autofagico per sostenere mitofagia e xenofagia, e si interfaccia con le vie dipendenti da NF-κB e TBK1 che regolano le risposte infiammatorie. Nel sistema endocitico, l’optineurina contribuisce alla dinamica di membrana e al traffico dei recettori tramite interazioni con le GTPasi Rab e con componenti del citoscheletro. Alterazioni genetiche o variazioni dell’espressione di OPTN sono state associate a fenotipi neurodegenerativi e oculari, inclusi sclerosi laterale amiotrofica e glaucoma, rendendolo un bersaglio prezioso per studi meccanicistici su proteostasi e infiammazione.

Optineurin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di OPTN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Optineurin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus OPTN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione OPTN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Optineurin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus OPTN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Optineurin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Optineurin nelle cellule tumorali con espressione di OPTN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.