OPN1SW Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400755-ACT

OPN1SW codifica l’opsina sensibile alle lunghezze d’onda corte (S-opsina), un recettore accoppiato a proteina G localizzato nei segmenti esterni dei fotorecettori conici che media la rilevazione della luce blu. Dopo l’assorbimento di un fotone, OPN1SW attiva la fototrasduzione dipendente dalla transducina, innescando la segnalazione della fosfodiesterasi del cGMP, la chiusura dei canali ionici regolati dal cGMP e le conseguenti variazioni del potenziale di membrana che modulano la trasmissione del segnale visivo. Una corretta espressione di OPN1SW e il legame con il cromoforo sono necessari per la funzione dei coni, la sintonizzazione spettrale e l’integrazione nei circuiti retinici. Alterazioni dell’attività delle opsine o disfunzioni dei fotorecettori conici sono rilevanti per i deficit ereditari della visione dei colori e per processi degenerativi retinici più ampi, a supporto di studi meccanicistici sulla biologia dei coni.

OPN1SW Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di OPN1SW senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

OPN1SW Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus OPN1SW nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione OPN1SW, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di OPN1SW. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus OPN1SW nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da OPN1SW nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via OPN1SW nelle cellule tumorali con espressione di OPN1SW silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.