Nur77 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418320-ACT

NR4A1 codifica per il recettore nucleare orfano Nur77, un fattore di trascrizione a risposta immediata (immediate-early) che collega rapidamente i segnali extracellulari ai programmi di espressione genica che controllano il destino cellulare. Nur77 integra la segnalazione a valle delle vie MAPK, PI3K/AKT e calcio-dipendenti per regolare apoptosi, proliferazione e adattamento metabolico, e può modulare le reti trascrizionali infiammatorie tramite crosstalk con NF-κB e AP-1. Nelle cellule immunitarie, Nur77 è un regolatore chiave dell’attivazione, della tolleranza e della differenziazione guidate dal recettore delle cellule T, influenzando i programmi citochinici e le risposte allo stress. Un’espressione o attività deregolata di NR4A1 è stata associata a condizioni infiammatorie e alla biologia del cancro, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico per ricerche focalizzate sulle vie di segnalazione.

Nur77 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NR4A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nur77 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NR4A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NR4A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nur77. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NR4A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nur77 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nur77 nelle cellule tumorali con espressione di NR4A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.