NMDAε4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401683-ACT

GRIN2D codifica la subunità del recettore NMDA umano NMDAε4 (GluN2D), una componente modulatrice dei recettori ionotropici del glutammato che regola la trasmissione sinaptica permeabile al Ca²⁺ e l’integrazione dei segnali dipendente dall’attività. L’incorporazione di NMDAε4 influenza la cinetica del canale, la sensibilità agli agonisti e i pattern di sviluppo della neurotrasmissione eccitatoria, modellando la plasticità sinaptica e l’eccitabilità delle reti neuronali. La segnalazione mediata dai recettori NMDA coinvolge vie calcio-dipendenti, tra cui CaMK/CREB, MAPK/ERK e programmi dipendenti dalla calcineurina, che regolano l’espressione genica e la maturazione delle sinapsi. La disregolazione della segnalazione glutammatergica legata a GRIN2D è stata associata a fenotipi neuroevolutivi e neurologici, rendendolo un locus utile per studi meccanicistici sullo stress eccitotossico, la funzione dei circuiti e le relazioni genotipo–fenotipo.

NMDAε4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GRIN2D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NMDAε4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GRIN2D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GRIN2D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NMDAε4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GRIN2D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NMDAε4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NMDAε4 nelle cellule tumorali con espressione di GRIN2D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.